Третья дочь в семье императора Николая II и императрицы Александры Федоровны в крещении получила имя Мария в честь небесной покровительницы Марии Магдалины, одной из жен-мироносец, чью память Православная Церковь чтит 22 июля (4 августа).
Княжна была поразительно красива: со светло-русыми волосами и большими темно-синими глазами, которые в семье ласково называли «Машкины блюдца». С. Я. Офросимова, фрейлина императрицы, писала о Марии с восторгом: «Ее смело можно назвать русской красавицей. Высокая, полная, с соболиными бровями, с ярким румянцем на открытом русском лице, она особенно мила русскому сердцу. Смотришь на нее и невольно представляешь ее одетой в русский боярский сарафан <…> Она весела и жива, но еще не проснулась для жизни; в ней, верно, таятся необъятные силы настоящей русской женщины».
Как и старшие сестры, Мария отличалась скромностью, непритязательностью, сердечностью и добротой. О характере княжны М. К. Дитерихс писал: «Великая княжна Мария Николаевна была самая красивая, типично русская, добродушная, веселая, с ровным характером, приветливая девушка. Она умела и любила поговорить с каждым, в особенности с простым человеком. Во время прогулок в парке вечно она, бывало, заводила разговоры с солдатами охраны, расспрашивала их и прекрасно помнила, у кого как звать жену, сколько ребятишек, сколько земли и т. п. У нее находилось всегда много общих тем для бесед с ними. За свою простоту она получила в семье кличку «Машка»; так звали ее сестры и цесаревич Алексей Николаевич». Друг их матери Лили Ден говорила, что Мария не была такой живой, как ее сестры, зато имела выработанное мировоззрение и всегда знала, чего хочет и зачем.
Как и старшие сестры, во время Первой мировой войны младшие Анастасия и Мария посещали раненых солдат в госпиталях. Они шили белье для солдат и их семей, готовили перевязочный материал. Обе сожалели, что из-за юного возраста не могли стать настоящими сестрами милосердия, как великие княжны Ольга и Татьяна. В обязанности младших состояли в том, чтобы развлекать раненых солдат. Мария предпочитала сидеть у изголовья и расспрашивать об их семьях, детях, и знала по именам практически всех.
Несмотря на юный возраст, великая княжна обладала незаурядным мужеством, которое проявила в страшные революционные дни. Анна Танеева писала: «…никогда не забуду ночь, когда немногие верные полки (Сводный, конвой Его Величества, Гвардейский экипаж и артиллерия) окружили дворец, так как бунтующие солдаты с пулеметами, грозя все разнести, толпами шли по улицам ко дворцу. Императрица вечером сидела у моей постели.
Тихонько, завернувшись в белый платок, Она вышла с Марией Николаевной к полкам, которые уже готовились покинуть дворец. И может быть, и они ушли бы в эту ночь, если бы не Государыня и Ее храбрая Дочь, которые со спокойствием до двенадцати часов обходили солдат, ободряя их словами и лаской, забывая при этом смертельную опасность, которой подвергались». В момент расстрела Мария стояла позади матери.